在單克隆抗體發(fā)現(xiàn)過程中，通過抗體庫的篩選，得到能夠與靶點特異性結(jié)合的優(yōu)秀候選分子后，就需要通過一定的工程化技術(shù)來增強其藥理學和其他方面的功能。多種策略可以改善抗體藥物的動力學功能，包括親和力成熟、嵌合或人性化和Fc修飾。為了提高抗體的成藥性和穩(wěn)定性，需要提高抗體的穩(wěn)定性和聚集性，以及降低免疫原性，其中一些策略也可以通過計算機工具來實現(xiàn)。

嵌合或人源化降低免疫原性

早期，鼠抗體進入人體后，會使人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答，及產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)，誘導(dǎo)超敏反應(yīng)或鼠抗體的作用被抗鼠抗體中和。解決這個問題的方法是通過嵌合或人性化，使抗體更接近人類抗體。人-鼠嵌合抗體是將鼠抗體可變區(qū)基因片段連接到人抗體恒定區(qū)基因上。人源化抗體是將鼠抗體的DCR區(qū)移植到人抗體的相應(yīng)部位，這樣人源化程度可達90%以上。

隨著計算機輔助模擬技術(shù)的發(fā)展，人源化抗體技術(shù)進入了第二代，其策略包括：①部分CDR移植，即將抗體結(jié)合抗原所必須的部分CDR移植到人抗體法人框架上，獲得免疫原性更小的人源化抗體；②表面重塑，即對鼠源CDR與FR表面殘基進行鑲嵌/重塑，使之類似于人抗體CDR的輪廓、人FR的形式；③特定決定區(qū)移植，即將抗體中與抗原密切作用的關(guān)鍵氨基酸形成的SDR移植到人抗體相應(yīng)的位置。此外，為了保證抗體的親和力，研究者還提出了CDR補償、定位保留和模板替換的策略。

盡管非人類抗體的人源化在今天仍然很普遍，但是轉(zhuǎn)基因老鼠的出現(xiàn)，更重要的是，全人(合成)抗體庫已經(jīng)減少了對這些策略的需求。然而，任何治療性的單抗都有免疫原性，無論其來源是什么，因此，在評估患者的風險-收益率時，應(yīng)始終考慮這一問題。

體外親和力成熟

對于治療性抗體來說，抗體親和力的提高有助于降低用量和毒副作用?？贵w體外親和力成熟策略來源于體內(nèi)抗體成熟過程(見圖1)。構(gòu)建集中突變或特點突變的小容量抗體庫，或?qū)⑼蛔円氲皆伎贵w的可變區(qū)域，通常是CDRs區(qū)，通過表面展示技術(shù)篩選出高親和力抗體。特別強調(diào)的是CDR H3在抗原識別和潛在構(gòu)象變化方面的獨特作用。同時，周圍的FR區(qū)域也應(yīng)該考慮在內(nèi)。一般情況下，均可以得到10倍的親和性改善。

為了模擬獲得性免疫系統(tǒng)，形成了一種具有人可變序列重排、細胞表面展示、弱結(jié)合分離以及重組AID介導(dǎo)的SHM體外哺乳動物系統(tǒng)。初步鑒定，低親和力的單克隆抗體在體外SHM中產(chǎn)生了一種低pM親和力。在SHM中，Ig基因插入和刪除增強了體內(nèi)和體外的親和力成熟。

圖1 工程化技術(shù)增強抗體藥理學和穩(wěn)定性

計算機工具也應(yīng)用于親和性的成熟。早期的計算機模擬集中于離子作用和單一突變體，以提高mAbs(如西妥昔單抗和貝伐單抗)的親和力10-100倍。另一種基于CDR3的隨機化和合理性設(shè)計的組合方法，將低μM scFv親和力提高了450倍。

并非所有的治療應(yīng)用都渴望獲得最佳療效的高親和力。在癌癥的背景下，高親和力binder受“結(jié)合位點屏障”作用，只能在腫瘤的邊緣部位進行定位。在另一個例子中，抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體mAbs只能在其親和力適中的情況下，在血液中傳遞有效載荷通過血腦屏障(BBB)。在這兩種情況下，具有較低的親和力的mAb仍然能夠與目標結(jié)合，但隨后被釋放，增強了對腫瘤和BBB的穿透能力。

Fc修飾增強效應(yīng)功能和半衰期

對Fc區(qū)域的修飾可以對特定抗體的藥理作用產(chǎn)生深遠的影響。重要的是，針對腫瘤的治療性mAbs的活動主要由激活和抑制Fcγ受體(FcγR)、FcγRIII或FcγRIIB參與主導(dǎo)。研究表明，細胞毒性的mAbs將會優(yōu)先與FcγRIII結(jié)合，同時減少FcγRIIB的參與，有更大的臨床療效。在利妥西單抗中，只對少量的氨基酸進行替換，在體外和體內(nèi)就顯示出了增強的ADCC作用。另外，糖基化修飾的改變也可以增強FcR的相互作用。利用GlycoMAb技術(shù)，使mAbs Fc區(qū)域表達平分的非核心巖藻糖，抗CD20抗體GA101比利妥西單抗具有更強的ADCC作用、抗腫瘤功效和B細胞耗竭。該技術(shù)與POTELLIGENT技術(shù)相結(jié)合，用于治療復(fù)發(fā)性或難治性成人T細胞白血病/淋巴瘤抗體藥Mogamulizumab已經(jīng)獲批。

圖2 血液及核內(nèi)體中IgG的Fc片段與新生兒受體FcRn的相互作用受pH影響

Fc的存在還會導(dǎo)致血液循環(huán)時間增加。許多研究已經(jīng)對Fc的修飾進行了研究，以延長抗體的半衰期。由于pH依賴FcRn的相互作用，誘變研究的重點是取代直接與FcRn結(jié)合的Fc氨基酸，以增加pH=6時親和力，而不是pH=7.4。雖然對增強的循環(huán)時間的Fc修飾可能會影響Fc的效應(yīng)功能，但研究表明，貝伐單抗和西妥昔單抗的不同AAs的突變導(dǎo)致了小鼠癌癥模型中更有效的抗腫瘤活性，從而驗證了增加治療性抗體的半衰期的策略。自那以后，有大量的有利突變被報道。不幸的是，動物模型的結(jié)果并不總是與人類相關(guān)。然而，與FcRn的親和性增加5-10倍，通常會導(dǎo)致半衰期增加2-4倍。

圖3 抗體ADCC和CDC效應(yīng)原理

提高穩(wěn)定性和降低聚合性

許多治療性的mAbs在非生理條件下表達時，具有有限的熱穩(wěn)定性和膠體穩(wěn)定性，使它們的制造和保質(zhì)期變得令人沮喪。因此，一些工程策略旨在提高mAb的物理特性，以提高其整體功效或生產(chǎn)能力。為了減少聚合而進行的研究主要集中在改變抗體框架、抗原結(jié)合環(huán)和結(jié)合域結(jié)合界面。更具體地說，穩(wěn)定策略包括：(a)劑型的調(diào)整;(b)特定點突變(框架和/或CDR);(c)在CH2-CH3域中添加額外的域內(nèi)二硫鍵;(d)改變Fab區(qū)二硫鍵結(jié)構(gòu);(e)和/或帶電的融合標簽。同樣，在計算機算法的發(fā)展過程中，利用合理的設(shè)計和體外選擇方法，可以抵消聚合，并預(yù)測高黏度、化學降解和快速血漿清除。

圖4 抗體的非天然聚合過程

以上的工程策略主要集中在改進“純”的mAbs上。除此之外，還有一些其他的生物共軛策略，以提高整體的mAb治療指數(shù)，每一個都有其自身的優(yōu)點和缺點。例如，批準的單抗與小分子藥物的偶聯(lián)或放射性同位素的結(jié)合，目的是將載體的力量集中到目標細胞/組織。另一種選擇是，雙特異性抗體和CAR-T細胞療法，旨在將T細胞重新定位為腫瘤治療癌癥，而納米技術(shù)則利用抗體作為靶向配體或作為診斷和/或藥物傳遞的有效載荷。

參考文獻：Kennedy P J,Oliveira C, Granja P L, et al. Monoclonal antibodies: technologies for early discovery and engineering[J]. Critical reviews in biotechnology, 2018, 38(3):394-408.