作為傳統(tǒng)活檢的替代技術(shù)以及癌癥早期篩查的新技術(shù)，液體活檢技術(shù)通過非侵入性的血液取樣方式獲得腫瘤信息以輔助癌癥治療，是“精準(zhǔn)醫(yī)療”領(lǐng)域中具代表性的診斷技術(shù)。

目前液體活檢主要腫瘤來源的生物標(biāo)志物分別是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、外泌體和循環(huán)RNA。這些物質(zhì)均可以通過腫瘤周邊的血管進(jìn)入血液循環(huán)，通過抽取血液樣本檢測這些物質(zhì)，可以用于腫瘤的早期診斷、療法選擇、預(yù)后判斷和療效監(jiān)測等。

圖：液體活檢的內(nèi)容和作用

一、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells， CTCs)

1869年，澳大利亞籍醫(yī)生Ashworth首次提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）的概念。目前，CTCs是指存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱。

CTCs轉(zhuǎn)移過程中必經(jīng)階段：

CTCs通過從腫瘤組織中脫落游走至血管，穿過血管進(jìn)入血循環(huán)，克服自身及血循環(huán)中各種因素的殺傷作用，到最后定植形成新的轉(zhuǎn)移灶等多個(gè)生理步驟，使得CTCs可順利侵襲轉(zhuǎn)移從而促進(jìn)相關(guān)疾病的進(jìn)展。

圖：CTCs轉(zhuǎn)移過程

CTCs的檢測：

對CTCs檢測包含細(xì)胞富集和細(xì)胞檢測兩部分，可以進(jìn)行不同的組合，形成不同的技術(shù)。最常見的富集方法是抗體介導(dǎo)或物理方法富集，接下來進(jìn)行免疫組織化學(xué)計(jì)數(shù)或遺傳分析。

圖：CTCs細(xì)胞富集和細(xì)胞檢測過程（A行顯示了磁珠-抗體富集方法；B行顯示了物理富集方法；C行顯示了最常用的細(xì)胞檢測方法。）

通過對血液中CTC的數(shù)量以及蛋白表達(dá)、序列檢測等可以獲取腫瘤的病變信息。

目前已發(fā)展出一代CTC技術(shù)用于對CTC數(shù)量檢測。

Immunicon公司的Cellsearch CTC 檢測系統(tǒng)2004年通過FDA認(rèn)證，也是唯一通過FDA批準(zhǔn)用于臨床的一代CTC檢測系統(tǒng)，可以說是行業(yè)內(nèi)的金標(biāo)準(zhǔn)。2012年Cellserach系統(tǒng)通過CFDA認(rèn)證進(jìn)入中國市場。目前Immunicon公司被強(qiáng)生子公司Veridex所收購。盡管一代CTC技術(shù)領(lǐng)先進(jìn)入臨床應(yīng)用，但目前技術(shù)水平尚不完善，只能用于對CTC數(shù)量的檢測，無法進(jìn)行進(jìn)一步的深入檢測，加上靈敏度較低，應(yīng)用局限于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌。

二代CTC技術(shù)正在加速研發(fā)實(shí)現(xiàn)中，相比于一代，二代CTC將能夠?qū)崿F(xiàn)對CTC細(xì)胞除數(shù)量以外的基因測序、蛋白表達(dá)、染色體變異水平等更全面的檢測，獲取更多腫瘤信息，同時(shí)靈敏度也將進(jìn)一步提高，做到腫瘤的提前發(fā)現(xiàn)和治療。二代CTC研發(fā)的參與公司眾多，但目前還沒有被批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品，沒有形成行業(yè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，更沒有行業(yè)巨頭出現(xiàn)，處于較多參與者競爭局面，技術(shù)不斷成熟當(dāng)中。

二、血漿游離腫瘤DNA('Cell-Free' Circulating Tumor DNA，ctDNA)

ctDNA（circulating tumor DNA）即循環(huán)腫瘤DNA，是人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動(dòng)的攜帶一定特征（包括突變，缺少，插入，重排，拷貝數(shù)異常，甲基化等）來自腫瘤基因的DNA片段。一般來源于壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞，循環(huán)腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體。通過對ctDNA片段捕獲測序可以獲得腫瘤特異性突變信息，幫助醫(yī)生診斷和個(gè)性化用藥指導(dǎo)。

圖：ctDNA來源

ctDNA的檢測：

ctDNA的檢測平臺目前有二代基因測序和數(shù)字化PCR，可分別對ctDNA的序列信息和序列數(shù)量做檢測，適用于非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、皮膚癌等常見腫瘤，檢測的目標(biāo)基因目前多以KRAS、PTEN、EGFR、BRAF等熱門基因?yàn)橹?。ctDNA的片段捕獲需要提前知道和準(zhǔn)備待檢測突變，突變文庫的制備過程繁瑣且高成本。ctDNA尚沒有FDA認(rèn)證產(chǎn)品問世，目前還處在科研階段。與CTC相比，二者均屬于液體活檢范疇，高靈敏度和低成本，適用于大多數(shù)腫瘤檢測，并且可同時(shí)從血液中提取，獲得互補(bǔ)信息。

三、外泌體(exosome)

外泌體（exosome）是細(xì)胞分泌出的包含了復(fù)雜 RNA 和蛋白質(zhì)的30-150nm的小囊泡，其主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中 。

1983年發(fā)現(xiàn)于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中的外泌體，近年來成了研究領(lǐng)域里的明星，大量的相關(guān)研究見諸報(bào)道。尤其2015年以來外泌體研究與應(yīng)用飛速發(fā)展，國自然基金外泌體中標(biāo)項(xiàng)目和文章發(fā)表數(shù)量大幅增加。

圖：外泌體國家自然科學(xué)基金中標(biāo)項(xiàng)目

外泌體與腫瘤發(fā)展

外泌體是腫瘤診斷、腫瘤發(fā)展和腫瘤治療的重要參與者。

外泌體的主要功能就是遞送各種生物分子，包括蛋白質(zhì)、多肽配體、DNA和RNAs。因此腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體在腫瘤發(fā)展和治療中扮演角色主要表現(xiàn)在以下方面：1、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)展，侵襲和轉(zhuǎn)移；2、促進(jìn)腫瘤的血管新生；3、腫瘤免疫調(diào)節(jié)；4、腫瘤化療的增敏作用。

圖：外泌體在腫瘤發(fā)展中的角色

外泌體的分析

外泌體數(shù)據(jù)庫 ExoCarta，目前已包含9769種蛋白質(zhì)，4946種mRNA條目，3408種mRNA，2838種miRNA，1116種脂質(zhì)條目。

通過超速離心法或者磁珠法提取外泌體后，分離純化出來的exosome可以做蛋白，也可以做RNA（microRNA和LncRNA），36%的研究人員通過Westernblot或其他方法來鑒定蛋白，29%的人員利用qPCR對microRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，9%利用芯片進(jìn)行microRNA表達(dá)譜分析。同時(shí)，新一代測序的用戶也不少，13%的人員利用NGS開展microRNA/小RNA研究，9% 開展mRNA研究，另外基于組學(xué)研究的質(zhì)譜分析法也越來越常用。此外，目前的大部分工作還是停留在科研階段，后續(xù)的生物標(biāo)志物開發(fā)和驗(yàn)證不多，而診斷和療法的開發(fā)就更少。Razvi認(rèn)為，exosome的定性和定量研究是個(gè)快速發(fā)展的市場。同時(shí)，循環(huán)生物標(biāo)志物的市場也存在著機(jī)遇和挑戰(zhàn)。不過，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)的成功讓人們相信，循環(huán)生物標(biāo)志物有望在腫瘤及其他疾病的診斷上發(fā)揮作用。

液體活檢技術(shù)使得癌癥早期階段的篩查成為可能，無論是腫瘤診斷，治療還是監(jiān)控領(lǐng)域，液體活檢的優(yōu)勢都使其成為最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷手段，具有極高的臨床應(yīng)用價(jià)值和市場前景。

整個(gè)液體活檢領(lǐng)域大致可以分為上游樣品捕獲技術(shù)，中游測序服務(wù)和下游數(shù)據(jù)分析。上游技術(shù)和下游的數(shù)據(jù)分析是技術(shù)壁壘較高的環(huán)節(jié)，目前的研發(fā)公司也都聚焦在上游的技術(shù)開發(fā)，數(shù)據(jù)積累是后續(xù)的環(huán)節(jié)?；驕y序則是比較成熟的環(huán)節(jié)，國內(nèi)提供測序服務(wù)的公司像華大基因、達(dá)安診斷等均已占據(jù)一定的市場，測序技術(shù)也在不斷更新?lián)Q代中。

圖：中國液體活檢企業(yè)產(chǎn)業(yè)布局匯總

根據(jù)動(dòng)脈網(wǎng)2017年中旬對國內(nèi)液體活檢相關(guān)企業(yè)產(chǎn)業(yè)布局的摸底，液體活檢可分為6個(gè)子領(lǐng)域，即上游的捕獲、基因擴(kuò)增、試劑以及儀器市場；中游檢測服務(wù)市場以及下游數(shù)據(jù)市場。

由于上游市場的技術(shù)難度較大，更多的企業(yè)選擇在中游環(huán)節(jié)布局。目前，涉足上游捕獲市場的企業(yè)有13家，基因擴(kuò)增相關(guān)企業(yè)6家，中游環(huán)節(jié)布局企業(yè)則有37家。

表：液體活檢相關(guān)企業(yè)掃描