概述

鹵代烷烴是藥物合成反應(yīng)中使用非常廣泛的烷基化試劑，例如鹽酸非索非那定和米拉美林合成工藝中使用碘甲烷作為烷基化試劑、4-氯甲基-5-甲基-1,3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮是奧美沙坦酯合成中用到的一個(gè)關(guān)鍵起始物料。2006年EMEA頒布的《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》和FDA發(fā)布的《原料藥和制劑中的基因毒性和遺傳毒性雜質(zhì)：推薦方法》中都有提到，由于鹵代烷烴的反應(yīng)活性很活潑，通過(guò)親電取代反應(yīng)，能夠與生物活性大分子（如DNAs、RNAs和蛋白質(zhì)）直接發(fā)生烷基化反應(yīng)，或鹵代烷烴可以在光照或其他激發(fā)能量作用下產(chǎn)生自由基，這兩種方式都對(duì)DNA進(jìn)行直接或間接作用，可能會(huì)導(dǎo)致DNA突變，與這類試劑接觸可能存在一些致癌風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重危害人類健康。

鹵代烷烴在藥物合成中大量使用，結(jié)構(gòu)種類繁多，是基因毒性雜質(zhì)中最為多見(jiàn)的一類。鹵代烷烴，單鹵代烯烴，氮芥，硫芥是典型的遺傳毒性致癌性物的警示結(jié)構(gòu)（如圖1），其中氯甲烷、氯乙烷已被證實(shí)為是已知的基因毒性雜質(zhì)。藥品合成中產(chǎn)生的鹵代烷烴中間體或雜質(zhì)是否為基因毒性雜質(zhì)是現(xiàn)階段藥物研究過(guò)程中重要討論和控制的內(nèi)容，也已成為國(guó)內(nèi)外藥品注冊(cè)審評(píng)不可缺少的項(xiàng)目，因此根據(jù)不同鹵代烷烴雜質(zhì)的性質(zhì)，需要在藥品中建立相應(yīng)的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行控制。

圖1.鹵代烷烴化合物結(jié)構(gòu)圖

根據(jù)參考各國(guó)藥典及文獻(xiàn)，總結(jié)了部分含有鹵代烷烴類基因毒雜質(zhì)藥物的種類，詳見(jiàn)表1。

表1. 含有酰氯類基因毒雜質(zhì)藥物列表

常用檢測(cè)方法

直接檢測(cè)法：

對(duì)于具有揮發(fā)性的鹵代烷烴，如鹵代甲烷、鹵代乙烷和鹵代丙烷，因其具有很強(qiáng)的揮發(fā)性，所以氣相色譜法是此類基因毒雜質(zhì)的主要分析手段。因一般常用的氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）的靈敏度較低，故多采用電子捕獲檢測(cè)器（ECD）作為檢測(cè)手段并結(jié)合頂空進(jìn)樣（HS）的方式來(lái)測(cè)定藥物中揮發(fā)性鹵代烴。有文獻(xiàn)顯示，相同濃度下的短鏈鹵代烷烴中，碘代烷烴的靈敏度最高，氯代烷烴的靈敏度最低，同時(shí)含有多個(gè)氯原子或者溴原子的烷烴也具有很高的靈敏度。因此，ECD檢測(cè)器更適用于測(cè)定含溴和含碘的烷烴化合物，尤其是含有多個(gè)鹵原子的烷烴，而對(duì)于只含有一個(gè)氯原子的烷烴化合物，一般采用靈敏度更高的氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)GC-MS進(jìn)行測(cè)定。

對(duì)于非揮發(fā)性的鹵代烷烴，HPLC-UV是藥物分析中最常用的分離檢測(cè)手段，該法適合于具有紫外吸收的鹵代烷烴，由于基因毒檢測(cè)是痕量檢測(cè)，故HPLC的檢測(cè)靈敏度就相對(duì)較低。而對(duì)于含N的鹵代化合物，常采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）法進(jìn)行測(cè)定，以達(dá)到提高檢測(cè)靈敏度的目的。

衍生化法：

當(dāng)樣品不能直接進(jìn)樣分析時(shí)，為了滿足分析方法的要求，同時(shí)也能夠提高鹵代烷烴的檢測(cè)靈敏度，通常會(huì)選擇柱前衍生的方法進(jìn)行檢測(cè)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用4-二甲氨基吡啶和1-（4-吡啶基）哌啶-4-甲酸正丁酯作為衍生化試劑，采用HILIC-MS/MS（親水相互作用色譜）及CE-MS（毛細(xì)管電泳法）測(cè)定鹵代烷烴，雖靈敏度可以達(dá)到，但都存在衍生化時(shí)間較長(zhǎng)的問(wèn)題。而采用二甲胺、三甲胺為衍生化試劑時(shí)，不僅能避免原料藥和其他物質(zhì)的干擾，且反應(yīng)簡(jiǎn)單快速，還能夠達(dá)到很高的檢測(cè)靈敏度（LOD能夠達(dá)到ng級(jí)）。除此之外，還有采用3-碘苯甲酰氯為衍生化試劑，采用LC-ICP-MS（電感耦合等離子體）來(lái)測(cè)定藥物中基因毒雜質(zhì)4-氯1-丁醇，其LOQ能夠達(dá)到1.25ng/mL。

以下兩個(gè)案例可供借鑒

雙丙戊酸鈉：

雙丙戊酸鈉（Divalproex sodium，化合物1，圖2），是新一代丙戊酸類衍生物，是一種新型廣譜低毒抗癲癇藥物。在雙丙戊酸鈉的合成工藝（圖2）中，一般以丙二酸二乙酯作為起始原料，在乙醇鈉溶液中，滴加1-溴丙烷試劑進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到中間體4，然后在酸性條件下水解，得到中間體5，之后在180℃減壓蒸餾3 h，脫羧得到中間體6，最后滴加NaOH溶液攪拌反應(yīng)制得雙丙戊酸鈉成品。雙丙戊酸鈉的合成工藝中使用到的1-溴丙烷試劑（化合物3，圖2），其結(jié)構(gòu)與已知基因毒性雜質(zhì)結(jié)構(gòu)類似，具有警示結(jié)構(gòu)，因此必須對(duì)其嚴(yán)格控制，控制其毒理學(xué)閾值（TTC）。根據(jù)ICH發(fā)布基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5 μg/d計(jì)算，雙丙戊酸鈉最大日劑用量為3g/d，則對(duì)應(yīng)的基因毒性雜質(zhì)1-溴丙烷的TTC水平為0.5ppm。

圖2. 雙丙戊酸鈉的合成工藝

因此，采用GC-MS，頂空進(jìn)樣的方法測(cè)定1-溴丙烷。根據(jù)ICH指南要求，對(duì)該方法進(jìn)行了檢測(cè)限（LOD）、定量限（LOQ）、線性、精密度、準(zhǔn)確性等相關(guān)驗(yàn)證，1-溴丙烷在0.1ppm~0.75 ppm的范圍內(nèi)均成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，1-溴丙烷的LOD和LOQ分別能夠達(dá)到0.05 ppm及0.1 ppm，平均回收率為97.3%，該方法靈敏度非常高、無(wú)干擾且操作簡(jiǎn)單，適合在痕量水平下對(duì)雙丙戊酸鈉中基因毒雜質(zhì)1-溴丙烷進(jìn)行控制。

阿瑞吡坦:

阿瑞吡坦（Aprepitant，化合物7，圖3）是美國(guó)Merck公司開發(fā)的一個(gè)具有全新作用機(jī)制的止吐藥，也是由美國(guó)FDA于2003年批準(zhǔn)上市的第一個(gè)神經(jīng)激肽-1（NK-1）受體阻滯劑。阿瑞吡坦的合成是以(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)嗎啉（化合物8，圖3）為中間體，與另一個(gè)中間體2-(2-氯-1-亞乙基)酰肼甲酸甲酯（化合物9，圖3）進(jìn)行縮合反應(yīng)得到中間體10，然后中間體10在高溫下環(huán)合制備而得到阿瑞吡坦成品。事實(shí)上，所用到的中間體2-(2-氯-1-亞乙基)酰肼甲酸甲酯（MIC，化合物9，圖3）已經(jīng)被證實(shí)具有潛在的遺傳毒性和致癌性，因此，依據(jù)EMA和FDA相應(yīng)的指導(dǎo)原則，有必要對(duì)阿瑞匹坦中的2-(2-氯-1-亞乙基)酰肼甲酸甲酯的殘留進(jìn)行定量分析。

圖3. 阿瑞吡坦合成工藝

因此，采用二甲胺為衍生化試劑，將MIC轉(zhuǎn)化為叔胺類衍生物MDC（如圖4），然后利用LC-MS的方法進(jìn)行檢測(cè)，以0.01M甲酸銨水溶液-甲醇為流動(dòng)相，在該方法下MIC的LOD和LOQ分別為1.2ppm和4.0ppm，在4.0~15.0 ppm的濃度范圍內(nèi)均成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，回收率為84.8-92.8%。該方法快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確且經(jīng)全面驗(yàn)證后符合檢測(cè)的需求。

圖4. MIC衍生化反應(yīng)式

總結(jié)

鹵代烷烴類化合物作為潛在的基因毒性雜質(zhì)，通常作為烷基化試劑存在于藥物合成過(guò)程中，這些微量的反應(yīng)試劑會(huì)作為雜質(zhì)存在于終產(chǎn)品中，可能具有遺傳毒性和致癌性而危害病人的健康。因此，藥品中如果含有上述種類的基因毒性雜質(zhì)，就需要對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的控制。由于鹵代烷烴類基因毒種類繁多，且化學(xué)性質(zhì)都非?；顫?，因此給分析方法的開發(fā)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。

基因毒性雜質(zhì)對(duì)藥品質(zhì)量的影響是不可忽視的，藥品研發(fā)人員、生產(chǎn)者應(yīng)盡可能地明確藥品中各類基因毒雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)、來(lái)源、毒性、檢測(cè)方法以及質(zhì)控限度，通過(guò)對(duì)藥品生產(chǎn)工藝的改進(jìn)及優(yōu)化來(lái)降低雜質(zhì)的含量，從起始原料控制、中間過(guò)程控制、終產(chǎn)品控制以及流通、貯藏等各個(gè)環(huán)節(jié)保證和提高藥品的質(zhì)量。在基因毒雜質(zhì)整個(gè)研究過(guò)程中，最重要的就是分析方法的開發(fā)與驗(yàn)證，需要從雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)、劑型特征、工藝過(guò)程等各個(gè)方面綜合考慮、嚴(yán)謹(jǐn)研究、規(guī)范驗(yàn)證。因此，建立一個(gè)科學(xué)可行的分析方法是基因毒雜質(zhì)研究與控制的基石。

本文根據(jù)以下文章進(jìn)行編輯整理，僅用于學(xué)習(xí)、交流：

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原標(biāo)題：純干貨｜全面剖析何為鹵代烷烴基因毒雜質(zhì)