至SARS-CoV-2大流行至今，尚無(wú)任何預(yù)防及治療方法獲批，而針對(duì)SARS-CoV-2的有效和普適性的疫苗上市時(shí)間仍懸而未定。因此，開(kāi)發(fā)新的治療和預(yù)防方法仍然至關(guān)重要。

9月，我們?cè)鴮?duì)發(fā)表于《Naturenature Communications》雜志的一篇文章做了報(bào)道，該文章描述，來(lái)自瑞典的科學(xué)家在一只名為“泰森（Tyson）”的羊駝（alpaca）體內(nèi)成功提取出可中和新冠病毒的納米抗體（單域抗體）Ty1。研究者發(fā)現(xiàn)Ty1會(huì)附著在與ACE2受體結(jié)合的刺突蛋白上，從而有效中和病毒。表明Ty1納米抗體可阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞，因此可以預(yù)防感染。

事實(shí)上，這已經(jīng)不是首次關(guān)于羊駝納米抗體可中和新冠病毒的報(bào)道，今年5月，《Cell》雜志同樣介紹了比利時(shí)根特大學(xué)及德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校等機(jī)構(gòu)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的來(lái)自大羊駝（也叫美洲駝，Llama）的新冠中和抗體。

近日，在一項(xiàng)發(fā)表于《Science》的新研究中，來(lái)自美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校等研究機(jī)構(gòu)的研究人員通過(guò)篩選酵母表面展示文庫(kù)（含有大于2×109種合成納米抗體序列）中與S蛋白胞外結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域（ectodomain）結(jié)合的納米抗體序列，分離出中和SARS-CoV-2的納米抗體。

在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)往大羊駝體內(nèi)注射了新冠病毒S蛋白的一種突變形式SpikeS2P作為抗原。SpikeS2P缺乏S1和S2結(jié)構(gòu)域之間的兩個(gè)蛋白裂解位點(diǎn)之一，并引入兩個(gè)突變和一個(gè)三聚化結(jié)構(gòu)域（trimerization domain）來(lái)穩(wěn)定S蛋白的融合前構(gòu)象。他們用生物素或用熒光染料標(biāo)記SpikeS2P，并通過(guò)磁珠結(jié)合和熒光活化細(xì)胞分選，來(lái)選擇展示納米抗體的酵母（圖1A）。

圖1.發(fā)現(xiàn)兩種不同類(lèi)別的抗S蛋白納米抗體。圖片來(lái)源：Science,doi:10.1126/science.abe3255

三輪篩選產(chǎn)生了21個(gè)獨(dú)特的結(jié)合SpikeS2P的納米抗體，而且ACE2胞外結(jié)構(gòu)域（ACE2-Fc）的二聚體構(gòu)造體可降低這種結(jié)合。這些納米抗體分為兩類(lèi)。第I類(lèi)納米抗體結(jié)合RBD并直接與ACE2-Fc競(jìng)爭(zhēng)（圖1B）。這一類(lèi)的典型例子是納米抗體Nb6，它可與SpikeS2P和RBD單獨(dú)結(jié)合時(shí)，結(jié)合常數(shù)KD分別為210nM和41nM（圖1C）。第II類(lèi)納米抗體，以納米抗體Nb3為例，它結(jié)合SpikeS2P(KD=61nM)，但不顯示與RBD單獨(dú)結(jié)合。在存在過(guò)量ACE2-Fc的情況下，Nb6和其他I類(lèi)納米抗體的結(jié)合完全被阻斷，而Nb3和其他II類(lèi)納米抗體的結(jié)合則適度下降（圖1B）。

這些結(jié)果表明，I類(lèi)納米抗體以RBD為靶點(diǎn)阻斷ACE2結(jié)合，而II類(lèi)納米抗體以其他表位為靶點(diǎn)。事實(shí)上，表面等離子共振（SPR）實(shí)驗(yàn)表明I類(lèi)和II類(lèi)納米抗體可以同時(shí)結(jié)合SpikeS2P（圖1D）。與SpikeS2P相比，I類(lèi)納米體與分離的RBD的結(jié)合呈現(xiàn)出一致更快的結(jié)合速率常數(shù)(ka)，這表明RBD可及性（accessibility）影響了KD。接下來(lái)，這些作者測(cè)試了I類(lèi)和II類(lèi)納米抗體抑制熒光標(biāo)記的SpikeS2P與表達(dá)ACE2的HEK293細(xì)胞結(jié)合的效率（圖1E）。

I類(lèi)納米抗體Nb6和Nb11作為兩個(gè)最有效的克隆出現(xiàn)，IC50值分別為370和540nM。II類(lèi)納米抗體在該試驗(yàn)中幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出活性。他們優(yōu)先選擇了兩種I類(lèi)納米抗體：Nb6和Nb11，它們強(qiáng)勁地結(jié)合SpikeS2P，與SpikeS2P或RBD結(jié)合之間的ka差異相對(duì)較小。對(duì)于II類(lèi)納米抗體，他們優(yōu)先考慮Nb3，這是基于它在純化過(guò)程中較高的相對(duì)產(chǎn)量。

阻止SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞的策略旨在阻斷ACE2-RBD的相互作用。雖然高親和力的單克隆抗體作為潛在的治療方法處于領(lǐng)先地位，但是它們通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的成本很高，并且需要由醫(yī)療保健專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行靜脈注射。預(yù)防性使用需要大劑量，這是因?yàn)橹挥幸恍〔糠挚贵w能穿過(guò)氣道內(nèi)的上皮細(xì)胞層。相比之下，納米抗體可以廉價(jià)地在細(xì)菌或酵母中產(chǎn)生，且納米抗體固有的穩(wěn)定性使得它們能夠直接霧化遞送到鼻腔和肺部上皮（圖2）。

圖2mNb6和mNb6-tri在霧化，凍干和熱處理后仍保持活性。圖片來(lái)源：Science,doi:10.1126/science.abe3255

事實(shí)上，靶向呼吸道合胞病毒的三聚體納米抗體（ALX-0171）的氣溶膠遞送最近被證明可以有效地降低住院嬰兒的可測(cè)量病毒載量。另外，駱駝?lì)愌苌{米抗體的潛在免疫原性可以通過(guò)既定的人源化策略來(lái)降低。

納米抗體多聚體化已被證明可以提高靶標(biāo)親和力（affinity）。針對(duì)Nb6和mNb6而言，同時(shí)參與所有三個(gè)RBD的多聚體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)引導(dǎo)設(shè)計(jì)，可顯著提高他們的效力。此外，鑒于RBDs必須處于向上構(gòu)象才能與ACE2結(jié)合，因此對(duì)RBD可訪(fǎng)問(wèn)性的構(gòu)象控制可作為一種附加的中和機(jī)制發(fā)揮作用。事實(shí)上，當(dāng)mNb6三聚體（mNb6-tri）與S蛋白結(jié)合時(shí)，它通過(guò)直接封閉結(jié)合位點(diǎn)和將RBD鎖定在非活性構(gòu)象來(lái)阻止ACE2結(jié)合。

總的來(lái)說(shuō)，研究者發(fā)現(xiàn)的II類(lèi)中和納米抗體展示了一種破壞S蛋白功能的潛在新機(jī)制。在預(yù)防或治療性雞尾酒療法中配對(duì)使用I類(lèi)和II類(lèi)納米抗體或可中和和阻止SARS-CoV-2的逃逸變體。因此，這些作者發(fā)篩選出的抗S蛋白納米抗體的組合穩(wěn)定性、有效性和多樣化的表位參結(jié)合為限制COVID-19大流行造成的持續(xù)死亡提供了一種獨(dú)特的潛在預(yù)防和治療策略。

參考資料：

1.An ultrapotent synthetic nanobody neutralizes SARS-CoV-2 by stabilizing inactive Spike