有史以來第一次，科學(xué)家們終于找到了一種可以有效、精確地從免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞中去除基因并插入外源正常基因的方法，而且更重要的是，這種操作所需的時(shí)間比通過病毒載體進(jìn)行基因遞送的時(shí)間短得多。

專家表示，如果該技術(shù)可以在其他實(shí)驗(yàn)室中復(fù)制，那么它可能為治療一系列疾病開辟了新的可能性，包括癌癥，HIV感染，狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病。相關(guān)的研究結(jié)果于2018年7月11日發(fā)表在《Nature》雜志上，賓夕法尼亞大學(xué)免疫學(xué)研究所主任John Wherry博士對此評價(jià)到：“這是一項(xiàng)重大進(jìn)展”。

病毒載體制造瓶頸

眾所周知，病毒在感染時(shí)可以有效地將其遺傳物質(zhì)引入靶細(xì)胞，并依賴宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制。自20世紀(jì)70年代以來，科學(xué)家們便利用這種能力，剝離病毒傳染特性，使用其產(chǎn)生的“病毒載體”將DNA遞送到細(xì)胞中去以達(dá)到基因治療的目的，而且近年來發(fā)展迅猛的CAR-T細(xì)胞療法也是基于病毒載體對T細(xì)胞進(jìn)行工程化設(shè)計(jì)的，這種遞送系統(tǒng)是包括CAR-T在內(nèi)的許多形式的基因治療的核心。

現(xiàn)如今，這種CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)上市。毫不夸張的說，沒有病毒載體，就沒有這種突破性療法，但制造這種病毒是一項(xiàng)艱苦而昂貴的過程，臨床級病毒載體的短缺導(dǎo)致了基因療法和基于細(xì)胞的療法的制造瓶頸。賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的基因治療項(xiàng)目負(fù)責(zé)人James M. Wilson在接受紐約時(shí)報(bào)采訪時(shí)，曾表示新病毒的等待時(shí)間可能長達(dá)數(shù)年。

而且即使可用，病毒載體也遠(yuǎn)非理想的方式，因?yàn)樗鼈儗⒒螂S意插入細(xì)胞基因組中，可能會損害現(xiàn)有的健康基因，或者保留新引入的基因，這些基因不受確保細(xì)胞正常運(yùn)作的調(diào)節(jié)機(jī)制的影響，可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。

因此，目前美國FDA要求對接受過病毒式轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的患者進(jìn)行15年的隨訪。

如果不用病毒載體遞送基因呢？事實(shí)上，在不使用病毒的情況下設(shè)計(jì)T細(xì)胞的想法并不新鮮，但免疫細(xì)胞很脆弱，很難在實(shí)驗(yàn)室中保持活力，而將所需基因?qū)爰?xì)胞中更是難上加難。

新技術(shù)到底有何過人之處呢？

Nature中描述的新方法提供了一種強(qiáng)大的分子“切割和粘貼”系統(tǒng)，用于重寫人類T細(xì)胞中的基因組序列。它依賴于電穿孔，是一種將電場施加到細(xì)胞上使其膜暫時(shí)更具滲透性的過程。在一年內(nèi)試驗(yàn)了數(shù)千個(gè)變量之后，加州大學(xué)舊金山分校(UCSF)的研究人員發(fā)現(xiàn)：

當(dāng)一定數(shù)量的T細(xì)胞，DNA和CRISPR“剪刀”混合在一起然后暴露在適當(dāng)?shù)碾妶鲋袝r(shí)，T細(xì)胞將會在吸收這些元素，精確地將特定的基因序列整合到基因組中的CRISPR編程位點(diǎn)。

作為論文通訊作者，UCSF的 Alex Marson博士表示：這是一種快速，靈活的方法，可用于改變、增強(qiáng)和重新編程T細(xì)胞，因此我們可以用這種方法實(shí)現(xiàn)我們想要的特異性，以消除癌癥，識別感染，或者遏制自身免疫性疾病中出現(xiàn)的過度免疫反應(yīng)。換句話說，現(xiàn)在我們已經(jīng)贏在了這條戰(zhàn)線的起點(diǎn)上。

但同樣重要的是新技術(shù)的速度和易用性，Marson表示：“這種方法可以將大量的DNA插入到T細(xì)胞中，賦予了細(xì)胞強(qiáng)大的新屬性。而在此之前，Marson實(shí)驗(yàn)室的成員使用電穿孔和CRISPR將一些遺傳物質(zhì)插入到T細(xì)胞中已經(jīng)取得了一些成功，但直到現(xiàn)在，許多研究人員多次嘗試將長序列的DNA置于T細(xì)胞中，通常都會導(dǎo)致大多數(shù)細(xì)胞死亡，因此大多數(shù)人認(rèn)為大型DNA序列對T細(xì)胞的毒性太大。

Theo Roth博士是論文的第一作者，他設(shè)計(jì)并領(lǐng)導(dǎo)了這項(xiàng)研究。他表示，嘗試將新基因?qū)隩細(xì)胞已經(jīng)有三十年的研究歷史了，現(xiàn)在，我們不在需要六七個(gè)人在實(shí)驗(yàn)室里使用病毒來設(shè)計(jì)T細(xì)胞了。在這種需求越來越大，所需要導(dǎo)入的DNA序列越來越復(fù)雜的環(huán)境中，我們需要的是嘗試更多的可能性，推動下一代細(xì)胞療法的快速發(fā)展。

經(jīng)過近一年的反復(fù)試驗(yàn)，Roth確定了T細(xì)胞群，DNA量和CRISPR豐度的比例，結(jié)合使用適當(dāng)參數(shù)傳遞的電場，可以有效且準(zhǔn)確地對T細(xì)胞基因組進(jìn)行編輯。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，Roth指示CRISPR用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記一系列不同的T細(xì)胞蛋白，結(jié)果表明：這種操作是高度特異性的，脫靶的幾率非常低。

然后，在補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中，Roth，Marson及其同事展示了這項(xiàng)新技術(shù)用于整合T細(xì)胞對抗自身免疫性疾病或癌癥的潛力。

自身免疫性疾病

在第一個(gè)例子中，Roth及其同事使用耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Kevan Herold博士提供給Marson實(shí)驗(yàn)室的T細(xì)胞。這些細(xì)胞來自三個(gè)患有罕見、嚴(yán)重的自身免疫性疾病的兄弟姐妹，迄今為止一直對治療抵抗力?；蚪M測序顯示這些兒童的T細(xì)胞攜帶一種名為IL2RA的基因突變。該基因帶有細(xì)胞表面受體的指令，這些細(xì)胞表面受體對于調(diào)節(jié)T細(xì)胞或Tregs的發(fā)育是必需的，其可以控制其他免疫細(xì)胞并防止自身免疫。

利用非病毒CRISPR技術(shù)修復(fù)IL2RA缺陷(圖片來源 nature)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：利用非病毒CRISPR技術(shù)，UCSF團(tuán)隊(duì)能夠快速修復(fù)兒童T細(xì)胞中的IL2RA缺陷，并恢復(fù)受突變影響的細(xì)胞信號。在CAR-T治療中，患者自身的T細(xì)胞被設(shè)計(jì)為具有強(qiáng)抗癌能力的CAR-T，然后回輸?shù)襟w內(nèi)以靶向腫瘤，研究人員希望類似的方法也可以有效治療Tregs出現(xiàn)故障的自身免疫性疾病。

抗癌潛力

在與加州大學(xué)洛杉磯分校Parker癌癥免疫療法研究所的Cristina Puig-Saus博士和Antoni Ribas博士合作進(jìn)行的第二組實(shí)驗(yàn)中，科學(xué)家們完全取代了正常人類T細(xì)胞群中的天然T細(xì)胞受體，專門設(shè)計(jì)了用于尋找人類黑色素瘤細(xì)胞的特定亞型的新受體。其中T細(xì)胞受體是細(xì)胞用于檢測疾病或感染的傳感器，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中，工程化細(xì)胞有效地歸巢于靶向黑素瘤細(xì)胞而忽略其他細(xì)胞，表現(xiàn)出了高度的特異性。

非病毒工程化的人T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤部位并顯示出抗癌活性(圖片來源 nature)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在不使用病毒的情況下，研究人員能夠生成大量經(jīng)過重新編程的CRISPR工程化細(xì)胞，表達(dá)出新的T細(xì)胞受體。當(dāng)轉(zhuǎn)移到植入人黑素瘤腫瘤的小鼠中時(shí)，工程化的人T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤部位并顯示出抗癌活性。

Marson說“這種替代T細(xì)胞受體的策略可以推廣到任何T細(xì)胞受體，通過這種新技術(shù)，我們可以剪切并粘貼到指定的位置，重寫基因組序列中的特定頁面。”

HIV感染

另外，Wherry博士還表示，這項(xiàng)技術(shù)對治療HIV也很有希望。HIV病毒感染T細(xì)胞，如果它們可以經(jīng)過工程化設(shè)計(jì)，使得病毒不能進(jìn)入T細(xì)胞，那么感染HIV的人，就不會進(jìn)展到艾滋病。那些已被感染的T細(xì)胞會死亡，而工程化細(xì)胞會取而代之。雖然先前已有研究表明，通過這種方式有可能治療HIV。但現(xiàn)在有了一個(gè)非常有效的新方法來做到這一點(diǎn)。

由于新技術(shù)可以在差不多一周的時(shí)間內(nèi)創(chuàng)建可行的定制T細(xì)胞系，因此它已經(jīng)改變了Marson實(shí)驗(yàn)室的研究環(huán)境。由于病毒載體帶來的障礙，之前認(rèn)為過于困難或昂貴的實(shí)驗(yàn)的想法現(xiàn)在已經(jīng)可以進(jìn)行了。Roth表示，他們將研究20個(gè)'瘋狂'的想法，因?yàn)榭梢苑浅？焖俚貏?chuàng)建CRISPR模板，而一旦有了模板，他們就可以將它放入T細(xì)胞并快速生長。”

功夫不負(fù)有心人：Marson博士將新方法的成功歸功于Roth的“絕對堅(jiān)持”，面對人們普遍認(rèn)為病毒載體是必需的，并且T細(xì)胞只能容忍小片段DNA。 Roth確信能夠找到合適的條件來克服這些明顯的局限性，并且他付出了巨大努力來測試數(shù)千種不同的條件：CRISPR與DNA的比例；細(xì)胞培養(yǎng)的不同方式；不同的電流。通過優(yōu)化每個(gè)參數(shù)并將最佳條件放在一起，最終他得到了這個(gè)驚人的結(jié)果。

目前，科學(xué)家們正在與美國FDA討論如何使用新方法精確攻擊實(shí)體腫瘤以及血血液腫瘤，希望能夠盡快推動這一技術(shù)應(yīng)用。

參考出處：

https://www.nature.com/articles/s41586-018-0326-5

https://www.ucsf.edu/news/2018/07/411071/t-cell-engineering-breakthrough-sidesteps-need-viruses-gene-editing

https://www.washingtonpost.com/news/speaking-of-science/wp/2018/07/11/with-new-genes-and-an-electric-shock-scientists-turn-immune-cells-against-cancer/?noredirect=on&utm_term=.8961e28cf9ff

https://www.nytimes.com/2018/07/11/health/gene-editing-cancer.html